02.10.2012
Опыт использования метода ПЦР для выявления РНК (ДНК) возбудителей вирусных гепатитов В и С у серонегативных доноров
Тема: Молекулярная биология (ПЦР)
Источник: Журнал "Справочник заведующего клинико-диагностической лабораторией"
Автор: О.А. Тарасенко зам. главного врача Головного центра гигиены и эпидемиологии ФМБА России, И.А. Гукасян канд. мед. наук, врач клинической лабораторной диагностики, Л.В. Соболевская врач клинической лабораторной диагностики, Т.В. Черненко врач клинической лабораторной диагностики Станция переливания крови Департамента здравоохранения г. Москвы
В настоящее время исследование образцов донорской крови для выявления маркеров вирусного гепатита В (ВГВ) и вирусного гепатита С (ВГС) проводят иммуноферментным (ИФА) или иммунохемилюминисцентным (ИХЛА) методами, позволяющими определять наличие в пробе крови поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) и антител к белкам вируса гепатита С (анти-HCV). Внедрение в лабораторную практику службы крови обязательного тестирования донорской крови для выявления названных маркеров позволило значительно снизить риск посттрансфузионной передачи вирусов гепатита В и С.
Известно, однако, что при ВГС специфические антитела появляются в среднем через 10–12 недель от момента заражения, а в некоторых случаях сроки их появления могут отодвигаться до 30–50 недель [2, 6]. Поэтому при исследовании методами ИФА или ИХЛА образцов крови, взятой у донора с ранней стадией ВГС, когда антитела еще не выявляются (период так называемого серонегативного окна), получают, как правило, ложноотрицательный результат. В то же время именно в этот период ВГС наблюдается выраженная виремия и связанная с ней высокая “инфекционная способность” инфицированной крови [2, 3, 6]. В связи с этим компоненты крови, заготовленные от донора, находящегося в периоде серонегативного окна, являются основным источником заражения реципиента ВГС при гемотрансфузии.
Использование NAT-технологий, в частности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяет выявить РНК HCV в крови уже через 1–2 недели после заражения, т. е. приблизительно за 60 дней до выявления анти-HCV серологическими тестами [8].
HBsAg в большинстве случаев является наиболее значимым серологическим маркером острого и хронического ВГВ, и выявление его в крови с высокой степенью вероятности свидетельствует о присутствии вируса [1, 2, 5, 6]. Однако зарегистрированы случаи заражения ВГВ при переливании HBsAg-негативной крови [7]. В настоящее время известно о существовании по крайней мере двух “ускользающих” (escape) мутаций HBsAg [9], которые могут возникать как естественным путем в ходе инфекционного процесса, так и после противовирусной терапии. Эти штаммы HBV способны передаваться горизонтальным путем и обусловливать ложноотрицательный результат при скрининге донорской крови на HBsAg. Описана так называемая “молчащая” форма ВГВ, характеризующаяся наличием низких концентраций вируса в крови при недетектируемом уровне HBsAg [2]. Она может наблюдаться у некоторых больных после острого ВГВ с самостоятельным разрешением и даже после успешно проведенного противовирусного лечения, а также при хроническом ВГВ. Установлено, что “молчащая” инфекция представляет клиническую форму ВГВ, способную передаваться через компоненты крови, а диагностика ее основывается на тщательном сборе анамнеза и применении высокочувствительного метода ПЦР для определения вирусной ДНК [1].
Задачей настоящей работы было оценить целесообразность использования метода ПЦР для скрининга донорской крови на наличие маркеров ВГС и ВГВ.
Пробы крови от каждого донора забирали в 2 пробирки: пробирку с разделительным гелем для получения сыворотки для серологических исследований и пробирку с ЭДТА для получения плазмы для ПЦР.
Выявление серологических маркеров ВИЧ 1, 2, ВГВ и ВГС проводили методом ИФА с использованием анализатора Evolis (компания Bio-Rad, США) или методом ИХЛА с использованием анализатора Architect (компания Abbott, США).
Для определения антител к HCV методами ИФА и ИХЛА использовали, соответственно, тест-системы Murex anti HCV (Abbott, США) и тест-системы Architect anti HCV (Abbott, США).
Для выявления HBsAg методом ИФА использовали тест-системы Monolisa HBsAg Ultra (Bio-Rad, США) и тест-системы Architect HBsAg (Abbott, США).
Образцы, показавшие при первичном исследовании методами ИФА или ИХЛА положительный результат на наличие анти-HIV 1, 2, анти-HCV или HBsAg, отбирали для повторного исследования с использованием тех же тест-систем, а также подтверждающих тестов.
Все серонегативные образцы исследовали методом ПЦР для выявления РНК HIV, HCV и ДНК HBV.
В течение 2008 г. ПЦР-исследования проводили на приборах Cobas Ampliprep/ Cobas Amplicor (компания Roch, Швейцария) с использованием тест-систем Cobas Ampliprep/Cobas Amplicor HIV 1 Monitor Test, Cobas Ampliprep/ Cobas Amplicor HCV Test и Cobas Amplicor HBV Monitor Test.
С января 2009 г. исследования выполняли методом ПЦР в режиме реального времени на инструментальном комплексе Cobas 201 (Roche, Швейцария), включающем пипетирующую рабочую станцию, аппарат для автоматического выделения нуклеиновых кислот Cobas Ampliprep и анализатор Cobas Taqman для автоматического проведения амплификации и детектирования нуклеиновых кислот с использованием 5-нуклеазной технологии.
Многоканальные оптические системы прибора позволяют регистрировать флуоресцентный сигнал от исследуемого образца в каждом цикле ПЦР. Для ПЦР-анализа серонегативных образцов использовали мультиплексные тест-системы CobasTaqScreen MPX Test, разработанные компанией Roche специально для скрининга донорской крови. За счет включения в реакционную смесь различных пар специфических праймеров и зондов эти системы позволяют выявлять одновременно в одной пробирке РНК HIV-1 группы М и группы О, HIV-2, HCV и ДНК HBV. Образцы, при исследовании которых регистрировали нарастание флуоресцентного сигнала, считали положительными, т. е. содержащими вирусную РНК (ДНК). Такие образцы исследовали повторно с использованием той же тест-системы. При получении повторно положительного результата проводили идентификацию выявленной нуклеиновой кислоты с помощью указанных выше ПЦР-диагностикумов на обнаружение отдельных инфекций.
При исследовании 56 983 серонегативных образцов донорской плазмы на наличие вирусной РНК (ДНК) на приборах Cobas Ampliprep/Cobas Amplicor при использовании наборов реагентов для отдельного выявления РНК HIV, HCV и ДНК HBV было выявлено 8 образцов, содержащих РНК HCV. При этом РНК HIV-1 и ДНК HBV ни в одном из исследованных образцов обнаружено не было.
При исследовании 62 438 серонегативных образцов на аппаратном комплексе Cobas 201 с помощью тест-систем CobasTagScreen МРХ в 31 случае было зарегистрировано нарастание флуоресцентного сигнала, свидетельствующее о наличии в образце вирусной РНК (ДНК). Дискриминатор ный анализ этих образцов с помощью тест-систем для отдельного выявления РНК HIV, HCV и ДНК HBV выявил в 16 из них РНК HCV, в 4 других – ДНК HBV в низкой концентрации (менее 60 МЕ/мл). Остальные 11 образцов, положительные при использовании теста CobasTagScreen МРХ, показали отрицательный результат раздельного выявления РНК HIV-1, РНК HCV и ДНК HBV. Однако при исследовании образцов, содержащих ДНК HBV, и образцов с неидентифицированной нуклеиновой кислотой (наличие ДНК не подтверждено системой для отдельного выявления РНК/ДНК) на наличие анти-НВсоr (таблица) во всех случаях выявили выраженную серологическую реакцию (коэффициент позитивности колебался в пределах от 7,8 до 8,6).
В 4 образцах были также обнаружены антитела к HBsAg (таблица). Наличие в образцах с неидентифицированной нуклеиновой кислотой серологических маркеров инфекции позволяет считать, что в них присутствует ДНК HBV в концентрации ниже предела чувствительности теста Cobas Amplicor HBV Monitor (40 МЕ/мл), выявляемая, однако, более чувствительной тест-системой CobasTagScreen MPX (3,3–4,4 МЕ/мл).
Обобщая полученные результаты, мы установили, что из 119 421 образцов донорской плазмы, показавших отрицательный результат в серологических тестах, методом ПЦР выявлено 24 образца (0,02%), содержащих РНК HCV. Нормальный уровень трансаминаз имели 16 доноров, образцы которых были HCV–позитивными, в то время как в 8 других в крови был зарегистрирован повышенный уровень активности АЛТ. Подобная картина может наблюдаться в период серонегативного окна и при хроническом ВГС у лиц с подавленным иммунитетом. Данные литературы, свидетельствующие об отсутствии прямой зависимости между уровнем АЛТ и наличием РНК HCV в сыворотке крови [4], позволяют считать, что обнаружение РНК HCV в крови является наиболее информативным показателем инфекции в период серонегативного окна.
Также нами было выявлено 11 образцов, содержащих ДНК HBV у HBsAg-негативных доноров, в том числе в четырех сохранялся низкий уровень виремии, несмотря на наличие анти-HBs. Известно, что подобное состояние иногда может наблюдаться длительное время после клинического выздоровления от острого ВГВ. Предполагают, что персистенция вируса в этом случае может осуществляться в форме иммунного комплекса с анти-HBs.
В остальных случаях сочетание низкого уровня виремии с наличием только анти-НВсог скорее укладывается в картину “молчащей” формы хронического ВГВ. Считают, что отрицательные результаты при детекции HBsAg у больных ВГВ могут быть вызваны низким уровнем HBsAg, образованием иммунных комплексов, а также мутациями вируса в S-регионе. Механизмы, поддерживающие низкий уровень репликации вируса при “молчащей” форме ВГВ, нуждаются в дальнейшем изучении. В настоящее время к факторам, способным поддерживать персистенцию вируса гепатита B в крови при “молчащей” инфекции, относят инфицирование вирусом моноцитов крови, формирование иммунных комплексов с антителами, ослабленный иммунитет и коинфекцию.
Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что скрининг образцов донорской крови с применением ПЦР-тестирования для выявления вирусной РНК (ДНК) позволит снизить риск посттрансфузионной передачи вирусов гапатита В и С за счет выявления инфицированных доноров, находящихся в периоде серонегативного окна, и доноров с “молчащей” формой инфекции. Алгоритм апробации донорской крови, при котором скрининг образцов методом ПЦР проводят одновременно с выполнением серологических тестов, позволит не только повысить инфекционную безопасность гемопродукции, но и сократить промежуток времени от момента забора крови до передачи ее в лечебные учреждения, что особенно важно для сохранения компонентов с ограниченным сроком годности.
Список использованной литературы
- Амосов А.Д. Гепатит В. 2-е изд. Кольцово, 2001. 128 с.
- Голосова Т.В., Никитин И.К. Гемотрансмиссивные инфекции. М., 2003. 191 с.
- Карякин А.В., Скоцеляс Е.Д., Терентьева Л.А. Мониторинг безопасности донорского контингента России // Трансфузиология. 2007. № 1–2.
- Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита / пер. с нем. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. С. 91–98.
- Малышев B.C., Федорова В.Д., Потехин О.Е. Маркеры вирусного гепатита В у доноров крови и в группах сравнения // Иммунопатология, аллергология, инфектология. 1999. № 1. С. 103–105.
- Рагимов А.А., Дашкова Н.Г. Основы трансфузионной иммунологии. М.: МИА, 2004. 280 с.
- Allain J.P. Occult hepatitis В virus infection: implication in transfusion // Vox Sang. 2004. Vol. 86. № 2. Р. 83–91.
- Busch M.P., Glynn S.A., Strainer S.L. et al. A new strategy for estimating risk of transfusion-transmitted viral infections based on rates of detection of resently infected donors // Transfusion. 2004. Vol. 45. P. 254–264.
- Gutierrez C., Devesa M., Loureiro C.L. et al. Molecular and serological evaluation of surface antigen negative hepatitis В virus infection in blood from Venezuela // J. Med.Virol. 2004. Vol. 3. №. 2. Р. 200–207.
