1. Общая характеристика инфекции гепатита В
1.1. Историческая справкаСуждения об инфекционной природе гепатита, распространенного заболевания печени, известного под названием катаральной желтухи, впервые были высказаны Боткиным в конце прошлого века. Со временем в результате широкого признания этой точки зрения вирусные гепатиты инфекционной природы стали называться болезнью Боткина. Спустя полвека, в сороковых годах нашего столетия, от инфекционного желудочно-кишечного гепатита А, распространяющегося перорально, стали отличать так называемый сывороточный гепатит В, передающийся парентерально — посредством зараженной крови. В 1963 г. Бланбергом в сыворотке крови аборигенов Австралии был открыт новый антиген, названный австралийским. Прошло еще несколько лет, и Принцем высказано предположение, что австралийский антиген является маркером гипотетического возбудителя сывороточного гепатита В. Наконец, в 1970 г. в сыворотке больного гепатитом В методом электронной микроскопии был обнаружен инфекционный вирус гепатита В (ВГВ) с поверхностным австралийским антигеном и позже в честь первооткрывателя назван частицей Дейна. В 1974 г. был выделен геном ВГВ, и в конце 70-х годов расшифрована его первичная нуклеотидная последовательность. Наравне с гепатитом В также были открыты и продолжают выявляться и изучаются другие вирусные гепатиты: A,C,D,E и др.
В этих исследованиях для дифференциальной диагностики и решения многих задач эпидемиологии и лечения гепатита В в 70–80-е г.г. успешно применялись высокоспецифические, высокочувствительные методы радиоиммунологического анализа. В настоящее время для этих целей повсеместно применяются новые методы иммуноферментного и ПЦР-анализов.
В последней четверти века методами молекулярной биологии, вирусологии, иммунологии и современными клиническими исследованиями достаточно глубоко изучены возбудитель инфекции — ВГВ, клинические проявления и последствия инфекции, патогенез гепатита В. Появились средства специфической профилактики и этиотропного лечения ВГВ-инфекции. Сегодня на этой базе эффективность клинической помощи тяжелым больным гепатитом В все больше определяется комплексным применением новейших методов и средств диагностики и лечения гепатита В и уровнем творческого привлечения лечащим врачом в своей повседневной практике результатов фундаментальных вирусологических, иммунологических и современных клинических исследований ВГВ-инфекции [1].
рис.2 представлена динамика выявления антигенных и иммунологических (антительных) маркеров гепатита В при остром вирусном гепатите В. В табл.1 дана сводка диагностических значений маркеров при их комплексном выявлении.
Таблица 1
Иммунологические маркеры при ВГВ-инфекции [18]
Диагноз
HBsAg
Анти-
Анти-НВс
HBeAg
Анти-
HBs
IgM
IgG
HBe Острый гепатит В:
+ (-)
-
+
+
+ (-)
- (+) реконвалесценция
- (+)
- (+)
- (+)
+
-
+ выздоровление
-
+ (-)
-
+
-
+ фулминантный гепатит
+ (-)
+
+
+
+
- Хронический персистирующий гепатит
+ (-)
-
+ (-)
+
+ (-)
+ (-) Хронический активный гепатит
+ (-)
-
+
+
+
- Здоровые носители
+
- (+)
-
+
-
- Активная иммунизация
-
+
-
-
-
- Пассивная иммунизация
-
+
-
(+)
-
-
Для прямого подтверждения диагноза ВГВ-инфекции, мониторинга хронической инфекции, изучения эффективности курса терапии гепатита В весьма информативно дополнительное определение генетического маркера (ДНК ВГВ) гибридизационным или наиболее высокочувствительным ПЦР-анализом. В качестве примера в табл. 2 и 3 представлены характеристики биотинилированных зондов для гибридизационного анализа и праймеров для ПЦР-зондового анализа ВГВ [20]. Все последовательности нуклеотидов даны по “плюс”-цепи ДНК ВГВ субтипа ayw. Позиции нуклеотидов на геномной карте даны в соответствии с [21].
Таблица 2
Характеристика биотинилированных зондов [20]
Вектор
Область генома
Размеры зонда, п.о. или последовательность нуклеотидов
Позиция в геномной карте РВR322
Полный геном ВГВ субтипа ayw
М13
Р-ген
584
1407-1991 М13
Р-ген
172
1234-1407 -
Р-ген
5'-ТТАСGTCCCGTCGGCGCTGAATC
1427-1449 -
S-ген
5'-TTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGC
403-426
Таблица 3
Характеристика праймеров для ПЦР-зондового анализа [20]
Область генома
Праймеры (5', 3')
Размеры
ПЦР-фрагмента, п.о.
Позиция в геномной карте Р-ген
5'-CTCTGCCGATCCATACTGCGGAA
5'-GCACTTCGCTTCACCTCTGCACG
348
1258-1280
1583-1605
Режим ПЦР: 56 °С (1 мин) - 72 °С (1 мин) - 94 °С (1 мин)
Для нестед-ПЦР
S-ген, внешняя рамка
5'-ATCAGGATTCCTAGGACCCC
5'-ATGGATTGATGTGGTATTGGG
590
171-190
741-760
Режим ПЦР: 50 °С (1 мин) - 72 °С (1 мин) - 94 °С (1 мин)
S-ген, внутренняя рамка
5'-GACTTCTCTCAATTTTCTAGG
5'-CTGCATGACTACTGCTCAAGG
283
263-284
525-545
Режим ПЦР: 50 °С (1 мин) - 72 °С (1 мин) - 94 °С (1 мин)
Примечание. В табл. 2 и 3 все ДНК-последовательности даны по плюс-цепи.
Для определения ВГВ чувствительность гибридизационного анализа с применением этих зондов оказывается сопоставимой с чувствительностью ИФА — определения НВs-антигена. Этой чувствительности, однако, часто недостаточно для выявления ДНК в случае латентной, хронической или врожденной инфекций. Резкое повышение чувствительности анализа достигается ПЦР-зондовым анализом или двойным нестед-ПЦР-зондовым анализом. Чувствительность нестед-ПЦР-анализа достаточна для выявления нескольких копий ДНК ВГВ в пробе, что превышает чувствительность ИФА в десятки и сотни тысяч раз.
Антигенные, иммунологические и генетические маркеры ВГВ-инфекции определяются лабораторным анализом с использованием диагностических тест-систем. Традиционная технология диагностикумов в качестве исходного вирусспецифического сырья пользуется антигенными препаратами, антителами от носителя инфекции или выделенными из сыворотки животного, иммунизированного вирусным препаратом. Недостатки традиционной технологии связаны с применением материала, потенциально опасного для здоровья персонала на производстве и аналитических лабораторий, и с ограничениями, вытекающими из трудностей получения воспроизводимых по своему качеству высокоочищенных препаратов вирусного антигена и поликлональных антител.
Альтернативная новая технология диагностикумов в принципе свободна от этих ограничений и недостатков. Исходные биокомпоненты тест-систем — это специфические последовательности нуклеотидов вирусного генома, рекомбинантные антигены и моноклональные антитела, получаемые молекулярно-биологическими методами и биоинженерной технологией. В табл. 4 представлен пример широкого применения рекомбинантных образцов HBs-, HBc- и HBe-антигенов, моноклональных антител к HBs- и HBe-антигенам, иммуноглобулинам класса М человека и ВГВ-специфических олигонуклеотидных праймеров для производства комплекса ИФА- и ПЦР-тест-систем ЗАО “Вектор-Бест” для диагностики гепатита В [20].
Таблица 4
Применение рекомбинантных антигенов ВГВ, моноклональных антител к вирусным антигенам, к иммуноглобулинам человека класса М и олигонуклеотидных ВГВ-специфических праймеров для выпуска ИФА- и ПЦР-диагностикумов
Маркеры
гепатита В
Принцип ИФА,
ПЦР-анализов
Адсорбирорванный на
планшете реагент
Конъюгат-
индикатор HBsAg
Сэндвич ИФА
МКА анти HBsAg
МКА анти HBsAg-РО Антитела HBsAg
Сэндвич ИФА
рек HBsAg
рек HBsAg-РО HBeAg
Сэндвич ИФА
МКА анти HBeAg
МКА анти HBeAg-РО Антитела IgG HBeAg
Сэндвич ИФА
рек HBeAg
МКА анти IgG-РО Антитела IgM HBcAg
Сэндвич ИФА
МКА анти IgM человека
рек HBcAg-РО Антитела HBcAg
Конкурентный ИФА
рек HBcAg
Антитела HBcAg-РО ДНК ВГВ
ПЦР-анализ
Электрофоретическое проявление ДНК ВГВ
Нестед-ПЦР
Ампликон, содержащий праймеры
Антитела 2,4Д-РО
В последние годы для объяснения особенностей тяжелой ВГВ-инфекции в качестве дополнительных маркеров инфекции стали применяться отличительные данные по генотипу возбудителя инфекции, наличие характерных мутационных замен, вставок и делеций в геноме инфицирующих штаммов ВГВ у больного. Устойчивые мутации обнаружены молекулярно-биологическими лабораторными методами в прекоровой, преS- и Х-областях генома ВГВ [22,24]. Это прежде всего результат точечной мутации в прекоровой области генома. Происходит замена гуанинового основания (G) на адениновое (А) в нуклеотиде на позиции (поз) 1896 от рестрикционного сайта EcoR1 (рис. 1
), что создает вместо 28-го триптофанового кодона UGG трансляционный стоп-кодон UAG, препятствующий синтезу и секреции НВе-антигена. Этот штамм вируса, возникающий путем спонтанной замены 83-го нуклеотида прекорового гена, обозначен как мутантный НВеAg-негативный ВГВ 83. Мутантный вирус синтезирует НВс-антиген и сохраняет способность к репликации и инфекционные свойства.
